Cuando Colón realizaba su tercer viaje a las "Indias Occidentales" y aún era muy reciente la adhesión del reino de Granada a los territorios de Castilla, nacía en Almodóvar del Campo (Ciudad Real) el 6 de enero, probablemente de 1500, Juan de Ávila, hijo único de una familia acomodada y judío-conversa por línea paterna.

Entre 1513 y 1537 fue estudiante de Artes y Leyes en la universidad de Salamanca. Aunque se desconocen los motivos del abandono de aquellos estudios, es probable que una crisis personal unida a su visión de los estudios de las leyes, a las que calificaba como "negras leyes", haya sido la causa del abandono y no, como se ha sostenido, razones de limpieza de sangre. No obstante, aquellos estudios fueron bien aprovechados como se colige de su obra y de determinadas intervenciones o consejos. Tras abandonar Salamanca, se retiró durante unos años en Almodóvar antes de marchar a Alcalá para realizar los estudios de Artes y Teología en su reciente universidad.

En Alcalá entró en contacto con un grupo de intelectuales, profesores y condiscípulos que, sin duda, dejaron su impronta en el futuro Bachiller Ávila. Entre ellos, Domingo de Soto, Juan de Medina, Pedro Ciruelo, Maestro Carrasco, Francisco de Vergara, Fernando Burgos, Fr. Dionisio Vázquez, y entre sus condiscípulos, Juan Egidio, Constantino de la Fuente, Juan de Valdés, Fernando Contreras, Pedro Guerrero. También en Alcalá recibió el erasmismo de los catedráticos complutenses y el recogimiento de los franciscanos. Terminados los estudios teológicos con el grado de Bachiller, se ordenó sacerdote en 1526 a los 26 años, y partió para Sevilla acompañando al dominico Julián Garcés con la intención de embarcar como misionero para las Indias. No llegó a hacerlo y es posible también que se le objetara su condición judeoconversa. Permaneció en la ciudad hispalense en contacto con Fernando Contreras, Fr. Domingo Valtanás y el arzobispo Alonso Manrique. Por aquel entonces, en Sevilla había recalado un grupo de personajes formados en las aulas complutenses, embebidos del llamado movimiento de Alcalá y degustadores de la obra de Erasmo; en Sevilla se había reunido un foco de tendencia luterana. En aquel ambiente la intransigencia entre cristianos viejos y nuevos se vivía con intensidad, y en aquel ambiente Juan de Ávila vivió sus primeros años pastorales. En 1532 fue acusado ante la Inquisición y durante algo más de un año permaneció encarcelado. Se le acusaba, entre otras cosas, de luteranismo y de simpatía hacia los judeoconversos. Salió sin mácula pero obligado a aclarar su postura en lugares en donde había predicado. En la prisión comenzó a redactar el Audi filia y de esa época datan algunas cartas que configurarían posteriormente su Epistolario.

Probablemente con la ayuda del obispo de Córdoba, el dominico Fr. Juan Álvarez de Toledo, se estableció en aquella diócesis e inició su obra educativa. Fue también en Córdoba en donde surgió la amistad con Fr. Luis de Granada. Durante algunos años su actividad se desarrolló en Granada siendo arzobispo Gaspar Dávalos; en las Actas capitulares de 1538 se recoge por primera vez el título de Maestro Ávila sin que se tenga constancia de la universidad en donde obtuvo el grado. De Granada partió para dar forma a la Universidad de Baeza (1539). Hasta su residencia definitiva en Montilla (1554) el Maestro Ávila no cejó de misionar por Andalucía, y otros puntos de la Mancha y Extremadura, al mismo tiempo que creó escuelas, colegios mayores y estudios generales, y formó una escuela de discípulos que continuarían su labor en campos diversos y específicos. Murió en Montilla el 10 de mayo de 1569.

En 1970 fue canonizado por Pablo VI y el 7 de octubre de 2012, Benedicto XVI lo declaró Doctor de la Iglesia universal.